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        人表皮生長因子基因重組腺病毒穿梭質粒的構建

        作者:2017-05-18 19:22閱讀:文章來源:網絡整理

          表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)是一種小分子多肽, 屬于促生長因子家族成員之一,最早由科恩博士在小鼠頜下腺中提取出, 具有刺激細胞外透明質酸和糖蛋白分泌,以及細胞內DNA、蛋白質的合成,對上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞等有較強的促增殖作用。表皮生長因子具有明顯的促進損傷修復的作用, 但也有一些缺點:①創面壞死物或炎癥因子會降低EGF 對損傷細胞的修復效應。②生長因子無法在創面局部保持長期有效的濃度。③需多次使用,抬高治療成本。如果能將hEGF 基因導入脂肪干細胞,使轉基因干細胞能持續分泌生長因子,再協同脂肪干細胞多向分化潛能,應該能提高創傷修復速度。因此,本實驗旨在構造含人表皮因子基因的重組穿梭質粒,為創傷修復奠定研究基礎。

          1 材料與方法

          1.1 質粒和試劑

          pYr-ads-6 腺病毒穿梭質粒購自湖南贏潤生物技術有限公司。T4 DNA 連接酶購自日本Takara 公司, 限制性內切酶均為MBI 公司產品,Taq 酶、dNTP、質粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒及Buffer 等均來自YRBIO 公司,DNA Marker 購自北京天根公司。pUC57 質粒與DH5α 菌株由醫學實驗中心實驗室保存。

          1.2 目的基因的合成

          根據Gene Bank 中已知Human cDNA EGF 序列,獲得hEGF cDNA 全序列(NM_001963),選擇合成EGF 基因的信號肽(signal peptide, sp) 片段(NM_001963,nt 453-nt 518)加hEGF 基因分泌肽片段(NM_001963, nt 3363-nt 3521),sp-hEGF 融合基因全長為234 bp,由南京金斯瑞生物科技公司用化學合成法行全基因合成。Sp-hEGF 基因合成時,在上游5’端引入NheI 酶切位點, 下游3’端引入SalⅠ酶切位點。

          1.3 克隆載體pUC 57-hEGF 構建和鑒定

          取sp-hEGF 基因片段6 μL,T4DNA 連接酶1 μL,pUC 57 質粒1 μL,反應體系如下:Buffer 緩沖液2.5 μL, ddH2O 14.5 μL, 16 ℃恒溫水浴過夜。取15 μL 連接產物轉化至感受態細胞DH5a[4]中,涂布在含氨芐的培養基上,37 ℃培養過夜, 挑取較大白色菌落,擴增培養后提取質粒,并做NdeⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

          1.4 穿梭表達質粒pYr-ads-6-hEGF 構建和鑒定

          依次用限制性內切酶NdeI、SalI 分別酶切克隆質粒pUC57-sp-hEGF 和腺病毒穿梭質粒pYr-ads-6,將酶切后的sp-hEGF 基因片段通過T4 DNA 連接酶克隆到穿梭質粒pYr-ads-6 上。反應體系為: 緩沖液1.5 μL,載體DNA 1μL,目的基因DNA 7 μL, T4 DNA連接酶1 μL,ddH2O 4.5 μL。輕輕混勻后,16 ℃連接過夜,次日將混合液轉化到感受態DH5a 細胞,產物涂布于含卡那霉素的培養基上,37 ℃培養過夜。次日挑選平板上較大的白色菌落,在培養基中擴增。按質粒提取試劑盒說明,獲得重組質粒pYr-ads-6-hEGF。限制性內切酶NdeI 和SalⅠ雙酶切重組質粒,挑選正確的陽性克隆,送南京金斯瑞生物科技公司測序。

          2 結果

          2.1 pUC57-hEGF 質粒酶切鑒定

          pUC57-hEGF 質粒的陽性克隆經Hind III 和NdeⅠ雙酶切, 切出2.4 Kb 載體帶和約540 bp 含有sp-hEGF 的小帶。

          2.2 pYr-ads-6-sp-hEGF 質粒酶切鑒定將sp-hEGF 片段亞克隆至pYr-ads-6 載體后,所獲陽性克隆經NdeⅠ與SalⅠ進行酶切,可切出約650bp 的小帶和5.8Kb 的大帶。初步推測sp-hEGF基因片段已經克隆到pYr-ads-6 載體。陽性克隆測序所得的序列和sp-hEGF 基因片段進行比對,顯示構建序列與預計堿基序列無差異,提示hEGF 腺病毒穿梭質粒構建成功。

          3 討論

          要想表達人表皮生長因子, 轉入原核質粒雖可獲得大量重組蛋白, 但原核質粒表達的重組蛋白缺乏相應的翻譯后修飾, 難以獲得真正意義上的活性蛋白質。而在真核表達體系中,可通過信號肽引導分泌性蛋白質到達內質網,經修飾后,再經高爾基復合體囊泡運輸可至胞外,從而發揮生物學效應??梢姷鞍踪|在向細胞外分泌的過程中,有賴于信號肽的介導。多個研究證明,信號肽主要功能是調節蛋白前體折疊,引導蛋白質穿膜運轉,對蛋白質的分泌有至關重要的作用。

          目前獲取目的基因的方法主要有3 種:反向轉錄法、從細胞基因組直接分離法和人工化學合成法。人工化學合成全基因目前是準確率最高,速度最快的方法。我們通過檢索NCBI GenBank 數據庫獲取人cDNAEGF 全基因序列為4875bp,全部用化學合成難度較大,且片段越大,成功轉入質粒概率越小。為提高合成基因的成功率和降低后續插入載體的難度, 選取hEGF 信號肽加分泌肽基因片段, 以使該融合基因在轉染細胞后能更好的分泌生長因子?,F有研究表明,在不更改氨基酸組成的條件下,DNA 序列通過人工合成可提高蛋白表達量?;蚧瘜W合成雖然不像PCR那樣能實現迅速高效的擴增,但卻有著不需要模板,直接面向序列等無法替代的優勢,可大大縮短制備目的基因的時間。

          后續實驗中,擬將pYr-ads-6-hEGF 質粒進一步做腺病毒包被,并感染脂肪干細胞,用于全層皮損的修復研究,考慮到到干細胞不易被轉染的特點,選擇了腺病毒穿梭質粒作為hEGF 表達載體。因腺病毒載體宿主范圍廣,可感染分裂和非分裂細胞、轉染效率高、病毒滴度濃度可控、外源基因裝載容量大等優點,已成為基因治療研究中常用的轉基因載體。本實驗中選擇的pYr-ads-6 質粒帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因,其示蹤作用有助于在后續試驗中,更好地了解目的基因在轉染細胞中的位置、擴散范圍和作用時相。pUC57-hEGF 質粒若采用克隆位點NheI 和SalⅠ酶切,應會切出約250 bp 的目的基因片段帶和2.7 Kb的大帶。但因250 bp 片段條帶不明顯,故換用質粒上的Hind III 和NdeⅠ進行酶切,得到540 bp 小帶與預測相符。最終將重組穿梭質粒pYr-ads-6-hEGF 雙酶切后,切出約650 bp 的小帶和5.8 Kb 的載體帶。所獲目的片段均與預期相符, 初步確定了重組體的正確。進一步通過基因測序將sp-hEGF 基因序列與Gen-Bank 所公布序列行堿基對比分析,兩者一致,證明pYr-ads-6-hEGF 腺病毒穿梭質粒構建成功。

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